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分子诊断学:基础与临床

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分子诊断学:基础与临床

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《分子诊断学 基础与临床》适用于各大医疗机构检验科、分子诊断实验室、科研机构、分子遗传学、生物医学、临床医学等相关学科的本科生、研究生、科研人员、临床医生等专业人员。相信从事科研、临床分子诊断的实验人员,临床医学、分子遗传学、生物医学等相关学科的工作人员、本科生、研究生等均可从《分子诊断学 基础与临床》得到启发及受益。
Content Description

分子诊断学随着理论的日趋完善和技术的不断进步,在检验医学领域发挥着越来越重要的作用。《分子诊断学 基础与临床》《分子诊断学 基础与临床》分为三大篇章。分别从理论、技术和应用三个侧面系统阐述了各项分子诊断技术的概念、原理、技术以及临床应用。第1篇是分子诊断学理论基础,着重介绍基因组学、转录组学、蛋白组学和代谢组学基础
理论;第二篇是分子诊断学技术,主要介绍基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学分子诊断的常用技术及微型化分子诊断技术、染色体分析技术及新发展;第三篇是分子诊断学的临床应用,详细介绍遗传性疾病、感染性疾病、肿瘤性疾病、复杂性疾病、移植前遗传缺陷、移植配型、法医学等的分子诊断及相关生物信息学。《分子诊断学 基础与临床》涵盖广泛,内容新颖,层次分明、结构合理、重点突出。由于参编人员均为长期从事分子生物学诊断教学和临床检测、应用的专业人员,有着丰富的理论背景和实践经验。因此《分子诊断学 基础与临床》不仅全面、系统地对国内外分子诊断学及技术的基础理论及发展动态进行了详细的阐述,并附有详细的、操作性强的分子诊断技术流程以及引物、实验条件等实践操作信息,力求在技术层面指导读者。
Catalogue

前言
绪论 1
一分子诊断学的定义 1
二分子诊断学的发展简史及主要技术 1
三分子诊断学在医学中的应用 5
四分子诊断的应用前景展望 8
第一篇 分子诊断学理论基础
第一章 基因组学 13
第一节 基因组学概论 13
一基因 13
二基因组 16
三基因组学 16
四基因组学的意义 17
第二节 原核生物基因组 21
一原核生物基因组特点 21
二原核生物基因组的类核结构 22
三质粒 22
四原核细胞的基因转移 23
第三节 真核生物基因组 24
一真核生物基因组的结构与功能 24
二线粒体基因组 29
三人类基因组研究 31
四人类基因组多样性 35
第四节 比较基因组学 38
一比较基因组学研究原理 39
二比较基因组学的几个相关概念 39
三比较基因组学的研究策略 40
四比较基因组学在基因分析中的应用 41
五比较基因组杂交技术在肿瘤研究中的应用 41
第五节 原核生物———微生物基因组 43
一大肠埃希菌基因组学 44
二流感嗜血杆菌基因组学 45
三阴沟肠杆菌基因组学 46
四鲍曼不动杆菌基因组学 47
五肺炎链球菌基因组学 49
六脑膜炎奈瑟菌基因组学 51
七铜绿假单胞菌基因组学 52
八结核分枝杆菌基因组学 53
九幽门螺杆菌基因组学 53
十衣原体基因组学 54
十一肺炎支原体基因组学 56
第六节 原核生物———病毒基因组 57
一病毒基因组学 58
二乙型肝炎病毒基因组学 59
三丙型肝炎病毒基因组学 61
四HIV基因组学 62
五人类乳头瘤病毒基因组学 69
六埃博拉病毒基因组学 71
七SARS病毒基因组学 72
八禽流感病毒基因组学 74
九肠道病毒基因组学 75
十单纯疱疹病毒基因组学 77
十一巨细胞病毒基因组 78
十二EB病毒基因组学 79
十三朊病毒基因组学 80
第二章 转录组学 82
第一节 基因表达的概念及特点 83
一基因表达的概念 83
二基因表达的时间性及空间性 83
三基因表达的方式 83
第二节 转录作用及组成 84
一转录作用及其特点 84
二RNA聚合酶 84
三启动子及终止信号 85
四增强子 86
五终止信号 86
第三节 真核基因转录过程 87
一 RNAPolⅡ的转录起始 87
二延长 88
三终止 88
第四节 转录后加工 88
一mRNA前体的加工 89
二tRNA前体的加工 91
三rRNA前体的加工 91
第五节 真核生物基因表达的调控 91
一染色体水平的调控 92
二染色质水平调控 93
三DNA水平的调控 95
四转录水平的调控 96
五转录起始和加工的调节 98
六翻译的调控 98
七小分子RNA的调控 99
第三章 蛋白组学 102
第一节 蛋白组学概论 102
一蛋白质组和蛋白质组学 102
二蛋白组学研究的意义和内容 102
三蛋白质组学的研究策略和一般步骤 103
第二节 蛋白质翻译后修饰及功能确定 104
一蛋白质翻译后修饰的种类 105
二蛋白质翻译后修饰的作用 105
三蛋白质修饰的蛋白组学研究 106
第三节 蛋白质与核酸间的相互作用 111
一蛋白质与DNA僅Df啌C3僅的相互作用 111
二蛋白质与RNA的相互作用 115
第四节 蛋白质与蛋白质间的相互作用 117
一蛋白质相互作用研究的意义 117
二蛋白质相互作用的分子结构基础 118
第五节 蛋白质组学的应用 121
一临床蛋白质组学 121
二药物蛋白质组学 127
三微生物蛋白质组学 129
四毒理蛋白质组学 132
第四章 代谢组学 133
第一节 代谢物靶标分析 133
一代谢物的生理作用 134
二代谢物靶标分析 134
第二节 代谢轮廓(谱)分析 138
一 高效液相色谱技术在代谢组学中的应用 139
二毛细管HPLCMS代谢组学研究 140
三UPLCMS的代谢组学研究 141
四HPLC在代谢组学研究中的地位 141
第三节 代谢指纹分析 142
一代谢指纹分析技术的进展 142
二代谢指纹分析在代谢组学研究中的作用 144
第四节 代谢组学 144
第二篇 分子诊断学技术
第一章 基因组学 151
第一节 核酸的分离和纯化 151
一真核基因组DNA的分离纯化 151
二基因组DNA的提取 154
三质粒DNA的提取与纯化 156
四真核细胞RNA的分离纯化 166
第二节 核酸分子杂交技术 170
一核酸杂交的基本原理 170
二核酸探针 170
三核酸探针的制备 172
四探针的标记及检测 173
五核酸分子杂交技术 180
第三节 基因扩增检验技术 186
一聚合酶链反应技术的原理 186
二聚合酶链反应技术的设计及优化 187
三聚合酶链反应技术的进展 194
四荧光定量聚合酶链反应技术 197
五有限稀释法 204
第四节 DNA指纹技术 204
一DNA指纹技术的原理 205
二DNA指纹技术的优点 205
三DNA指纹图的遗传规律 206
四典型案例 206
五STR分析个体基因型原理 206
六DNA指纹技术的应用 207
第五节 核酸测序技术 207
一核酸测序策略 208
二链末端终止法 208
三化学降解法 210
四焦磷酸测序技术 211
五其他测序技术 212
六自动化测序技术 214
第六节 微型化分子诊断技术 216
一微型芯片 217
二DNA芯片技术 221
三微毛细管电泳 226
四微珠技术 227
五可寻址微阵列技术 236
六生物传感器技术 237
第七节 DNA重组技术 238
一工具酶 239
二载体 242
三DNA重组技术 244
第八节 染色体分析技术 257
一染色体核型分析 257
二分子细胞遗传学技术 263
三比较基因组杂交技术 267
四光谱核型分析技术 269
五无创DNA产前检测技术 271
第九节 其他基因诊断技术 271
一基因变异检测技术 271
二二维基因扫描技术 276
三脉冲场凝胶电泳技术 276
四分子影像技术 277
第二章 转录组学技术篇 282
第一节 转录组学概论 282
第二节 基于序列分析的转录组学技术 283
一cDNA文库随机抽样 283
二大规模表达序列标签测定及分析 283
三基因表达系列分析 284
四大规模平行标识测序 287
五RNA测序 288
第三节 基于杂交的转录组学技术 289
一差异显示RT PCR及限制性酶切片段差异显示 289
二DNA微阵列和Tillingarray 289
第四节 小结 292
第三章 蛋白组学 293
第一节 蛋白质的分离技术 293
一等电聚焦凝胶电泳技术 294
二SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 298
三二维电泳图像分析技术 301
四蛋白质分离技术的发展 305
第二节 蛋白质的鉴定技术 308
一生物质谱技术 308
二Edman降解技术 320
三蛋白质分子结构分析技术 321
第三节 蛋白质芯片技术 324
一蛋白质芯片原理 324
二蛋白质芯片技术 325
第四节 蛋白质核酸相互作用研究技术 328
一凝胶阻滞实验 328
二DNAaseI足纹分析技术 330
三酵母单杂交技术 331
四染色质免疫沉淀技术 332
五核酸适体技术 333
六扫描探针显微镜技术 334
七表面等离子共振技术和生物分子相互作用分析 336
第五节 蛋白质蛋白质相互作用研究技术 337
一免疫共沉淀 337
二酵母双杂交技术 340
三串联亲和纯化技术 341
四质谱技术 343
五蛋白质芯片 344
六生物信息分析 345
第四章 生物信息学 348
第一节 人类基因组计划 348
一人类基因组计划的发展 348
二人类基因组计划研究内容 348
第二节 生物信息学 349
一生物信息学的定义 349
二生物信息学的研究内容 350
三生物信息学数据库 350
四生物信息学的临床应用 355
第三篇 分子诊断学的临床应用
第一章 遗传性疾病的分子诊断 383
第一节 分子诊断学相关的遗传学咨询和伦理学 383
一遗传咨询 383
二遗传咨询中的伦理问题 383
三遗传检查中的伦理问题 384
第二节 遗传性疾病分子诊断的策略 384
一 直接诊断策略 384
二基因多态性连锁分析 385
三基因突变的定量诊断 385
第三节 遗传病的分子诊断 385
一血液系统疾病 385
二神经和神经肌肉疾病 392
三内分泌疾病 396
四囊性纤维化 402
五脆性X综合征 404
第二章 感染性疾病的分子诊断 406
第一节 感染性疾病分子诊断的策略 406
一一般性检出策略和方法 406
二完整检出策略和方法 407
第二节 病毒感染的分子诊断 407
一乙型肝炎病毒的分子诊断 408
二丙型肝炎病毒的分子诊断 412
三人乳头瘤病毒的分子诊断 415
四单纯疱疹病毒的分子诊断 419
五人类免疫缺陷病毒的分子诊断 420
六EB病毒的分子诊断 424
第三节 病原菌基因的分子诊断 425
一结核分枝杆菌的分子诊断 425
二金黄色葡萄球菌 428
三大肠埃希菌的分子诊断 432
四流感嗜血杆菌的分子诊断 435
五肺炎链球菌的分子诊断 436
六脑膜炎奈瑟菌的分子诊断 438
七铜绿假单胞菌的分子诊断 440
八幽门螺杆菌的分子诊断 441
第四节 其他常见病原微生物的分子诊断 443
一沙眼衣原体的分子诊断 443
二解脲脲原体的分子诊断 445
三梅毒螺旋体的分子诊断 447
四肺炎支原体的分子诊断 448
第五节 院内感染的分子诊断 449
一分子生物学技术在耐药机制研究中的应用 449
二分子生物技术在医院感染控制中的应用 450
第三章 药物遗传学及耐药性的分子诊断 453
第一节 药物遗传学 453
一药物遗传学研究的现状 453
二人类基因组研究与药物遗传学的发展 454
第二节 耐药性的分子机制 455
一细菌的耐药性机制 455
二真菌的耐药机制 456
三病毒的耐药机制 457
四肿瘤耐药的机制 458
第三节 耐药性分子诊断的策略 459
一基于测序技术的检测方法 459
二基于DNA扩增(polymerasechainreaction,PCR)的检测方法 460
三基于分子杂交技术的检测方法 461
第四节 微生物的耐药性分子诊断 461
一结核分枝杆菌的耐药性分子诊断 461
二大肠埃希菌耐药性分子诊断 466
三耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性分子诊断 468
四乙肝病毒耐药性分子诊断 470
五获得性免疫缺陷病毒(HIV)耐药性分子诊断 472
第五节 抗肿瘤药物的耐药性分子诊断 474
一实时FQ PCR检测乳腺癌MDR 1MRPLRPGST πTopo Ⅱ
多药耐药基因 475
二RT PCR法检测耐药相关基因表达的测定 476
三基因芯片检测肿瘤患者多药耐药基因1(MDR 1)多态性 476
第六节 个体化医疗治疗监控 478
第七节 基因治疗安全性评估 479
第四章 肿瘤性疾病的分子诊断 482
第一节 肿瘤发生的分子机制和易感性 482
一恶性肿瘤是一种分子病 482
二肿瘤发生的分子机制 483
三肿瘤发生的易感性 490
第二节 肿瘤分子诊断的策略 491
第三节 癌基因与抑癌基因的分子诊断途径 492
一染色体不稳定性分析 492
二肿瘤易感基因的检测 492
三肿瘤基因多态性检测 492
四肿瘤相关基因蛋白质水平检测 493
五肿瘤相关基因扩增/过表达突变/缺失的检测 493
六表观遗传修饰的检测 494
七染色体微卫星异常分析 495
八端粒酶活性的检测 496
九基因表达图谱研究 497
第四节 常用肿瘤的分子诊断 499
一乳腺癌的分子诊断 499
二膀胱癌的分子诊断 500
三肺癌的分子诊断 501
四消化系统恶性肿瘤的基因诊断 503
五血液系统肿瘤的分子诊断 503
六肿瘤早期筛查的分子诊断 509
七肿瘤微小残留病的分子诊断 510
第五章 复杂性疾病的分子诊断 513
第一节 复杂性疾病的分子诊断策略 513
一复杂性疾病分子诊断的定义和原理 513
二复杂性疾病分子诊断常用的检测标本 514
三分子诊断的常用方法与思路 514
第二节 常见疾病的分子诊断 515
一糖尿病 515
二高血压 518
三家族性高脂血症 522
四肾小球肾炎 525
五支气管哮喘 528
第六章 产前(胚胎植入前)遗传缺陷的分子诊断 531
第一节 染色体异常的分子诊断 531
一分子细胞遗传学方法 531
二分子遗传学方法 533
第二节 非整倍体筛选 534
一人类染色体非整倍体的形成 534
二胎儿染色体非整倍体类疾病的产前筛查及诊断 535
第三节 产前(胚胎植入前)遗传缺陷的分子诊断的概述 535
一胚胎植入前分子诊断的概念 535
二胚胎植入前分子诊断的意义 535
三胚胎植入前的技术操作 536
四胚胎植入前分子诊断常用的方法 537
第四节 植入前遗传诊断在一些遗传病的应用 538
一21三体综合征的植入前遗传诊断 538
二克氏综合征的植入前遗传诊断 539
三苯丙酮尿症的植入前遗传诊断 539
四脆性X染色体综合征的植入前遗传诊断 539
五地中海贫血的植入前遗传诊断 542
六马凡综合征的植入前遗传诊断 542
七脊髓性肌萎缩症的植入前遗传诊断 543
八杜氏肌营养不良症的植入前遗传诊断 544
第七章 移植配型的分子诊断 546
第一节 HLA遗传学基础 546
一 HLA的研究简史和命名 546
二HLA复合体的遗传结构和功能 547
三HLA复合体的遗传特征 549
四小结 550
第二节 组织配型中的DNA分型技术 551
一聚合酶链反应限制性片段长度多态性 551
二聚合酶链反应序列特异性寡核苷酸 552
三PCR 序列特异性引物分型法 552
四聚合酶链反应单链构象特异性 553
五指纹图谱技术 554
六SBT PCR分型法 554
七基因芯片 555
八小结 555
第三节 HLA配型在器官移植中的应用 556
一人红细胞血型抗原相容 556
二HLA配型 556
三HLA交叉配型与预存抗体的检测 557
四HLA配型与不同的器官移植的相关性 558
五小结 559
第八章 法医学的分子诊断 560
第一节 DNA多态性 560
一DNA多态性标记物 560
第二节 DNA分型技术与方法 564
一DNA指纹技术 564
二PCR技术 565
三DNA芯片 566
第三节 DNA数据库 566
一DNA数据库的概念 566
二DNA数据库的组成 566
三DNA数据库的国内外发展状况 567
四DNA数据库的功能与应用 567
第四节 法医DNA鉴定的应用范围 569
一种属鉴定 569
二性别鉴定 569
三个人识别 569
四亲权鉴定 571
第九章 分子诊断实验室的质量管理 574
第一节 全面质量管理体系的概念与建立 574
一全面质量管理体系的概念 574
二质量管理体系的建立 575
第二节 质量控制诸要素 576
一设施与环境 576
二检验方法仪器及外部供应品 576
三操作手册 577
四方法性能规格的建立和确认 577
五仪器和检测系统的维护和功能检查 577
六校准和校准验证 577
七室内质量控制 577
八室间质量评价 580
九纠正措施 581
十质控记录 581
第三节 统计学质量控制 581
一理想的质控品 581
二LeveyJennings质控图 581
三Westgard多规则质控方法 585
四累计和(CUSUM)质控方法 586
五质控规则的性能特征 587
第四节 分析前中后质量保证 587
一分析前质量保证 587
二分析中质量保证 588
三分析后的质量保证 589
第五节 实验室认可和认证 590
一实验室认可 590
二实验室认证 590
三实验室认可与认证区别 591
参考文献 592
Book Abstract

一分子诊断学的定义
分子诊断学从出现之日起,在检验医学领域就一直受到对其“身份”的挑战有人认为分子学诊断只是对一些生物大分子-DNARNA或蛋白质检测方法和技术的汇总,就像我们通常不将标记技术称为标记诊断学,发光技术称为发光诊断学一样,分子诊断学也不应独立成为一门学科;也有人认为“分子诊断学”的概念太过狭义人们习惯于将“诊断学”理解成临床上用来诊断疾病的各种检查程序实际上,分子诊断学更重要的意义还在于对疾病的研究和指导治疗,分子诊断能为临床提供包括诊断在内的各种丰富的信息然而,无论人们怎样看待,对临床实验室来说,分子诊断学出现的意义和价值已不容忽视在不到十年的时间里,基于全基因组信息的分子诊断学技术已经发展成为可以对许多疾病和易患病体质进行检测的强有力工具
在定义分子诊断学时,最值得关注的是其诊断内涵的拓展分子诊断学早已突破了单纯分子生物学理论和技术的范畴,也不再仅局限于对疾病的筛查和诊断当今分子诊断学的发展更有助于阐明疾病发生发展的分子学机制;有助于从分子基础上对疾病的异质类型进行区分鉴别;有助于为疾病进程各阶段提供准确特异的分子诊断指标;有助于疾病的早期筛查殁鉴别诊断;有助于从分子基础上为临床制订治疗方案判断治疗效果;有助于判断某些疾病的易感人群及易感分子学基础;有助于为分子治疗提供有效的靶向及追踪
如果说在分子诊断学问世之前,人们对疾病的诊断仅仅基于对机体各种代谢指标的变化,抗原抗体的水平,病理形态学特征的掌握来进行判断随着分子生物学的迅速发展,对基因组学蛋白组学以及表观遗传学研究的不断深入,人们开始尝试采用基因芯片等技术来分析外源性致病原基因和(或)机体内部基因表达谱的改变;尝试采用质谱仪等技术来分析蛋白与基因的关系,蛋白与蛋白的关系,以及蛋白质谱的变化,通过识别这些分子标记(molecular signature)来对疾病作出分类和诊断
因此,分子诊断学可以理解为是一门将分子生物学分子遗传学原理和技术应用于疾病的实验室诊断学科,其将分子生物的理论和技术与实验室医学有机地结合在了一起分子诊断学的核心是基于核酸和蛋白的诊断技术,通过检测各种机体外源性及内源性生物分子以及分子体系的存在结构或表达调控等改变,为疾病的预测诊断治疗预后及转归提供分子水平上的诊断信息
二分子诊断学的发展简史及主要技术
1949年,Pauling殁其同事发现p一血红蛋白氨基酸序列上一个特定氨基酸的改变导致了镰形红细胞性贫血的发生,由此引入了分子疾病( molecular disease)的概念,此后的研究进一步揭示了这种氨基酸序列的改变源自DNA序列上某个特定碱基的改变,这些发现使人们认识到疾病的发生发展与生物大分子改变之间的密切联系,并意识到可以通过检测某些特定的分子来诊断疾病,这种诊断方式较之前的通过观察病理改变和临床症状进行诊断更为准确,尽管在当时并没有适当的技术手段支持这种想法成为现实,但无疑为分子诊断学的诞生奠定了基础
分子诊断学的发展与分子生物学的发展密不可分,分子生物学为分子诊断学提供了主要的理论基础和技术手段,1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋之后,分子生物学开始作为一门独立学科迅速发展分子诊断学也在此基础上开始出现并渐具规模分子诊断学的发展及其技术进步大致可分为以下三个阶段:基于杂交技术的分子诊断阶段;基于PCR技术的分子诊断阶段;后基因组时代基于生物芯片等技术的高通量分析诊断阶段
1.基于杂交技术的分子诊断技术 20世纪70年代,DNA重组技术迅速发展,cDNA克隆和测序技术使得人们对多种基因的基本序列有了初步认识,为分子诊断学的出现提供了理论基础探针技术Southern印迹等印迹技术为分子诊断学提供了方法和手段,分子诊断学由此进入了第一个技术突破阶段,即基于杂交技术的分子诊断阶段
1976年,Kan及其同事历史上第一次通过杂交技术分析了胎儿的成纤维细胞DNA,实施了a-地中海性贫血的产前诊断1978年Kan和Dozy完成了镰形红细胞性贫血的分子诊断此后,一系列类似遗传性疾病的基因诊断方法相继建立,如1983年Woo等建立的苯丙酮酸尿症的基因诊断方法;1986年,Farrall等建立的对膀胱纤维化的诊断方法,等等
1982年,Orkin等发现经肉切酶消化后,基因组DNA所呈现的不同大小片段与特定的』3一血红蛋白基因突变相偶联,这种限制片段长度多态性( restriction fragment length polymorphism,RFLP)技术可
用来比较不同个体DNA水平上的差异(即多态性),从而建立起一种针对致病性基因突变的初筛方法
基于杂交技术的基因分析方法主要有:①Southern印迹(Southern blotting);②Northern印迹(Northern blotting);③斑点杂交(dot blotting);④原位杂交(i扎situ hybridization);⑤RFLP分析技术等
基于杂交技术的分子诊断方法在当时主要应用于遗传疾病的基因诊断它是第一种真正意义上的分子检验技术,在分子诊断学的发展中具有开创性的地位
虽然核酸分子杂交技术的应用仅有二十多年的历史,但它在核酸的结构和功能研究中作出了重要贡献,在基因的表达调控和物种的亲缘关系研究中也功不可没但在当时,基于杂交技术的基因诊断技术仍有很多不足例如,致病性突变的确定只能通过建立患者基因组DNA文库的方式来进行,技术复杂,周期长,对样品纯度要求较高,样品用量太,费用高;检测中需采用放射性物质,限制了其广泛应用;RFLP分析多态性的信息含量低,多态性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数量,RFLP多态性图谱的建立较为繁琐等,这些都使得该技术的应用受到了一定的限制
如今,随着核酸探针制备及标记技术的不断丰富和完善,以不同材料为支持物的固相杂交技术(如基因芯片)的应运而生,为核酸分子杂交技术在分子生物学领域中的应用开辟了新的天地
2.基于PCR技术的分子诊断技术 Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想,1985年美国PE - Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应,但所用酶为DNA聚合酶I的Klenow片段,精确性差,且不耐热;1988年,Keohanog改用精确性更好T4 DNA聚合酶进行PCR扩增,但此酶仍不耐热;同年Saiki从水生嗜热杆菌(Ther7T/us aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶用于PCR反应,命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA polymerase),此酶的发现使得PCR技术获得了广泛应用
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端豆补的寡核苷酸引物反应由变性退火延伸三个基本反应步骤构成,经多次循环后使得靶序列成指数扩增,数小时内即可将目的基因扩增放大百万倍,甚至千亿倍PCR技术不仅减少甚至取消了放射性物质的使用,而且可以使极微量样本在短时间内得到指数级扩增,这些特点使得分子诊断学得以进入临床检验实验室,用于一些已知基因突变的检查工作,如:某些遗传疾病的产前诊断病原微生物基因的检测等,成为临床上必不可少的常规检查技术
随着PCR技术的广泛应用和发展,根据靶序列扩增后的检测方法,以PCR为基础的核酸检测技术大体可分为三类:
(l)基于酶处理技术的检测方法:RFLP是最早获得广泛应用的变异检测技术,根据PCR产物中限制性内切酶的位点,用相应的限制性内切酶进行酶切后,即可获得不同大小的片段,这些片段可以通过杂交或电泳进行鉴定,且能应用于靶基因分型及变异性研究
除此之外,还有一些基于DNA序列二级结构的技术,例如T4内切酶Ⅶ和T7内切酶IT7内切酶I可以识别并切割不完全匹配的DNA十字形DNA结构Holliday结构或DNA分叉点等结构,将目的基因的野生型DNA片段变性后与PCR扩增产物进行杂交,如果产物DNA序列含有基因突变,则与对应的野生型DNA片段形成不完全匹配的异源二聚体DNA,从而被T7内切酶工切割,对切割产物进行分析可判断PCR扩增的目的基因序列中是否含有突变及具体的突变位点;
寡核苷酸连接分析是基于连接酶的分析方法该方法设计有两个寡核苷酸片段,与野生型基因互补且头尾相接,如PCR扩增产物序列与野生型序列一致,变性杂交后,两个片段头尾相接,连接酶可将两者连接,形成双链反之,如果PCR产物序列在两段寡核苷酸连接处存在变异,则不能连接
(2)基于电泳技术的检测方法:电泳是PCR产物检测最常用的方法,除可单独使用外,也可与酶切技术联合使用由于DNA片段具有双性电离的特征,在一定的黾泳缓冲液中带有电荷,DNA片段长度的大小会影响电泳的迁移率,从而可以通过电泳加以区分
目前常用的电泳分析技术有:
1)单链构象多态性( singlestrand conformation polymorphism,SSCP)分析:单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象,这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的,当有一个碱基发生改变时,会或多或少地影响其空间构象,使构象发生改变,空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同因此,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),可以非常敏锐地将构象差异的分子分离开
2)杂合双链分析法(heteroduplex analyses,HA):该法与SSCP相似,所不同的是SSCP分离的是单链DNA,HA法分离的是双链DNAHA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型野生型DNA杂化双链由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起,在非变性凝胶中电泳时,会产生与相应的同源双链DNA不同的迁移率HA对一些不能用SSCP检出的突变有互补作用,两者结合使用,可使突变检出率提高到近100% 这两种方法存在一些局隈性,例如,只适用于200- 300 bp的片段;只能检测突变存在与否,要最后确定突变的位置和类型,还需进一步测序;对电泳条件要求较严格等此外,由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的,所以当某些位置的点突变对构象不起作用或作用很小时,电泳无法分辨
尽管如此,SSCP和HA仍有较高的检测率,而且简便快速灵敏,不需要特殊的仪器且价格低廉,可以同时检测多种不同的序列变异,适合临床实验的需要,易于自动化,可用于高通量DNA变异的检测对于未知基因的突变,扩增产物可先经SSCP或HA分析,然后进一步提纯,最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段必须强调的是,尽管有着多种DNA变异的检测方法,基因序列测定仍然是变异检测的金标准
3) DGGE和TGGE:变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)最初是
由I_erman等于20世纪80年代初期发明的,起初主要用来检测DNA片段中的点突变Muyzer等在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究后来又发展出其衍生技术——温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel electrophoresis, TGGE).
取链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时,其迁移行为决定于其分子大小和电荷不同长度的DNA片段能够被区分开,但同样长度便难以区分DGGE/TGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上,加入了变性剂(尿素和甲酰胺)梯度或是温度梯度的因素,从而能够将同样长度但序列不同的DNA片段,依据其不同的解链区域或解链温度区分开来这两项技术目前广泛应用于微生物种群分析等领域
4)二维电泳技术:在X轴聚丙烯酰胺凝胶电泳的基础上。
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